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常见问题

抗体如何保存?
抗体保存的质量直接决定了抗体的活性和使用效果,请务必按照说明书推荐的保存条件正确保存抗体,并且避免抗体反复冻融。
实验操作中如何避免组织脱片?
1、组织处理不当:按照《临床技术操作规范 病理学分册》进行组织处理,脱水彻底,尽量不选择脂肪多的组织。
2、组织切片太厚、不均匀等,一般建议组织切片厚度在3-5μm,切片时保持切片的完整和均匀,避免出现褶皱。
3、抗原修复过程操作不当,如修复过度或修复结束后迅速冷却,请按照抗体说明书中建议的抗原修复方式,进行正确的抗原修复操作。
4、烤片条件不当,如烤片温度过低、时间过短等,建议烤片温度高于包埋的石蜡熔点3-5℃(或60-70℃)为适,烤片时间为1-2h。
5、冲洗方式不当,如冲洗时对着组织冲洗,请采用正确的冲洗方式加以避免。
组织切片染色结果为阴性,如何解决?
1、真阴性。设立“阳性对照”,如果阳性对照染色正常,可排除试剂和操作的原因。此时,如受测组织或细胞出现阴性染色,说明受测组织或细胞没有相应的抗原表达。
2、假阴性。 阳性对照和受测组织均显示阴性。
(1) 实验操作不当,如漏加某一试剂、试剂滴加顺序有误、抗原修复操作有误等。建议按照规范的实验方法进行实验;
(2)一抗与二抗检测系统不相符。建议根据一抗的种属选择相匹配的检测系统;
(3)抗原含量过低,建议使用具有放大效应的二抗检测系统;
(4)抗体稀释比例过高或使用了不合适的抗体稀释液。建议按照指导意见对抗体进行稀释;
(5)抗体过了有效期或者抗体保存条件不当。建议在有效期内正确使用抗体产品;
(6)水溶性色原显色后使用了含醇的复染液或用乙醇脱水,二甲苯透明(如AP-Red、AEC、BCIP/NBT等显色试剂)。建议使用正确的复染液封片剂重新染色。
导致组织切片染色弱的原因有哪些?如何避免?
1、 标本的固定:不当的固定方式或固定时温度过高,都会影响到所检测的抗原的数量和质量。查看一抗说明书或相关文献,使用推荐的固定液(如10%中性缓冲福尔马林固定液等)。
2、抗原的修复方式:煮沸修复和高压修复是国际公认的较好的修复方式,但具体使用那种修复方式应根据预实验结果或厂家说明书进行选择。
3、抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。应参照使用范围,对所使用的一抗进行梯度测试,找出最佳的使用浓度。通常,如果背景染色很少或没有,可适当延长孵育时间。
4、切片上遗留了过多的冲洗液,当抗体加至切片上时,等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
5、 孵育时切片是否放置水平,否则会导致抗体流失。
产生组织切片非特异性染色的原因有哪些?如何解决?
1) 抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色,这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。
2) 一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色,建议试用单克隆抗体。
3) 内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高(含血细胞多的组织),需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。
4) 非特异性组分与抗体结合,这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。
5) DAB孵育时间过长或浓度过高,可通过降低DAB浓度或者缩短孵育时间来降低背景染色。
6) PBS冲洗不充分,残留抗体结果增强着色,在一抗/二抗/SP孵育后的浸洗尤为重要。
7) 标本染色过程中经常出现干片,这容易增强非特异性着色,确保实验过程中保证切片的湿润。
8) 抗体稀释液的pH值偏低和封闭血清的失效。

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